|
沈紫霞，常 毅，刘巧香，郭 刚，马 慧，李有志，廖晨星*，刘国世* 1 中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193 2 北京首农食品集团有限公司，北京 100028 3 山东省饲料兽药质量检验中心，山东济南 250109 褪黑素（Melatonin，MT），化学名为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，属于吲哚类色胺，一种主要由松果腺分泌的神经内分泌激素[1]。褪黑素不仅在催眠、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤方面有一定成效[1]，还可以维持机体内的代谢稳定[2]； 1.1 气相色谱法和气相色谱-质谱联用法气相色谱法（GC）是一种以气体为流动相的柱色谱法，根据所用固定相状态的不同可分为气-固色谱（GSC）和气-液色谱（GLC）[9]。质谱分析法主要是根据被测样品离子的质荷比来进行分析[9]。采用气相色谱法和气相色谱-质谱联用法测定褪黑素时，毛细管柱和程序升温较为常用，如以15℃/min的升温速率从60 ℃升至280 ℃并持续5 min，或是在90 ℃持续1 min后再升温至275 ℃并持续10 min。载体通常选择电离电位较高的气体（如氦气），质谱均采用电子轰击70 eV离子源。在上述条件下，样品中的褪黑素、其他药物和杂质能够完全分离并得到各自的MS图[10]。采用外标法或是同位素内标法进行峰面积定量[11]。 该方法有以下几点优势：（1）分析速度快、分离效率高：由于样品在气相中传递时的快速性，样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间达到平衡状态； 1.2 高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法在诸多褪黑素测定方法中，高效液相色谱法（HPLC）是使用最广泛的[14]。它的原理是以液体作为流动相，用高压输液系统把不同极性的缓冲液、溶剂等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离，随后进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析[15]。高效液相色谱测定通常采用反向C18填料，大多采用70∶30到50∶50的甲醛-水作为流动相[16]，另外也有使用磷酸盐缓冲液-乙腈[17]的。由于褪黑素的极性较小，流动相的pH对色谱影响不大，一般采用流动相pH范围为3～4，多采用磷酸盐、冰乙酸等控制[18]。检测生物样品（如牛奶）时，由于紫外检测器的灵敏度较低，一般不采用，常采用灵敏度较高的电化学检测器（ED）或荧光检测器（FD）。高效液相色谱测定褪黑素时通常采用外标法定量，标准曲线在较大浓度范围具有良好的线性[19]。 高效液相色谱具有高效、高速以及高分辨力等优点，与合适的检测器联用后牛奶中褪黑素检测限可达1 μg/mL[20]，但该法的前处理步骤繁琐、耗时长[13]。高效液相色谱通常与质谱分析法联用，即高效液相色谱-质谱联用法，其分离度和灵敏度比高效液相色谱更高[13]，对空气中目标物的检出限可达0.2 ng/mL[21]，牛奶中褪黑素的检测限数量级在10 pg/mL，且该法也具有更广的使用范围。 1.3 放射免疫测定法放射免疫分析（RIA）的本质是标记抗原和非标记抗原对特异抗体的竞争性抑制反应[22]。褪黑素的放射免疫分析测定是利用标记褪黑素与特异的免抗血清结合，在反应平衡后加入待测样品，温度恒定在4 ℃，待反应充分平衡再进行分离并测量计数[22]。放射免疫分析测定法的操作步骤包括抗原的制备与标记、特异性抗体的制备以及抗原抗体复合物与游离抗原的分离。当需要同时测定大量样品时，一般选择放射免疫测定法[8]。该法中的125I-褪黑素这类抗原在应用前需要进行氧化制备及高效液相色谱分离； 放射免疫测定法优点在于褪黑素不必提纯就可以测量，同时能达到较高的灵敏度，检测限可达1 pg/mL[23]，重现性也不错[22]。但不足之处在于其测量值仅代表免疫学活性，检测过程中会使用放射性同位素，而且它的测定不易被标准化[24]。 1.4 酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定（ELISA）是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型免疫测定技术[22]，它的原理在于将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合[25]。这种方法既可以用来测定抗原也可以用来测定抗体。在反应过程中，对固相载体上的酶标抗原或抗体被结合量等进行统计、分析，通过洗涤处理去除反应液中的其他物质，在加入酶反应底物后，底物可以通过酶催化转变为有色产物，最后采用定性或定量分析的方式，对有色产物量进行检验分析，以达检测目的[26]。鉴于其高灵敏性，近年来逐渐有研究者采用酶联免疫吸附试剂盒测定牛奶中褪黑素的含量[27]。根据具体操作过程不同，酶联免疫吸附测定分为多种类型，如双抗体夹心测抗原、双抗原夹心测抗体以及竞争法测抗体或抗原等都是常见的几类酶联免疫吸附测定法。 酶联免疫测定技术的敏感性高，检出限为每孔0.2 pg[8]，反应物稳定性较高，相对放射免疫测定法来说不存在放射性危险。但这种方法对实验设备和操作的高要求性限制了其应用范围[22]。 1.5 紫外分光光度法紫外分光光度法（UV）是根据组分含量与吸收光谱呈线性关系进行分析，它一般与多种化学信息学方法相结合，从而对多组分混合物进行定性定量分析[28]。由于褪黑素易溶于甲醇、不溶于水，因此在使用紫外分光光度计法测定褪黑素时，可以直接以甲醇作为溶剂来进行超声提取，也可以直接采用无水乙醇为溶剂提取（保证振荡充分）。当待测样的辅料为微晶纤维素、淀粉、碳酸氢钙等物质时，可以使用紫外分光光度计法，不会干扰测定。但当辅料成分比较复杂或含有其他吲哚类药物时，对待测样品处理的要求会比较高，这种情况往往不建议使用该法。因此在褪黑素的含量测定中，紫外分光光度计法一般只用于制剂辅料较为简单的情况，再结合导数分光光度法，能得到较好的标准曲线线性关系，结果准确、可靠。褪黑素在紫外光波长为223 nm和277 nm处有最大吸收，目前常选用277 nm作为检测波长[8]。同时采用外标法定量，能够具有良好的线性。 由此可见，紫外分光光度计法的优点在于可以对多组分混合物进行分析测定，结果也较为准确可靠，最低检测限为0.025 μg／mL[8]。但该法对待测样品要求较高，样品成分较复杂的情况下不推荐。 在上述提到的几种测褪黑素的方法中，气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法的灵敏度高于气相色谱法和高效液相色谱法。与气相色谱-质谱联用法相比，高效液相色谱-质谱联用法在特异性、适用性以及样品检测量方面都存在较大的优势。但这几种方法也存在耗时较长、成本相对高的弊端。与之相反的是放射免疫测定法，对于待测样品中的褪黑素不必提纯就能进行测量，比较适合样本量较大的情况，目前放射免疫试剂盒的应用也相对比较普及了。但放射免疫测定法的测定不易标准化，测值可靠度不全面。酶联免疫吸附法不存在放射性危险，且该技术敏感度较高，但由于实验设备及操作的原因无法广泛使用。紫外分光光度计法只适合成分较简单的待测样品，如褪黑素片剂或胶囊，这类样品辅料成分简单，不存在干扰结果的情况； |